Cloning and Bioinformatics Analysis of Key Gene ME in Malic Acid Metabolism of Sea Buckthorn

Huang Yao　Li He ^*　Bao Bowen　Huang Lan　Huang Jiani　Fan Yuchang

The college of Ecological Environmental and Resources, Dalian Minzu University, Dalian, 116600

* Corresponding author, lihe@dlnu.edu.cn

Abstract　Malice enzymes (MEs) are key enzymes in malic acid metabolism in plant, which involved in the degradation of malic acid. In this study, the specific primers were designed based on the sea buckthorn transcriptome sequencing data. Afterwards ME genes (including NAD-ME and NADP-ME) were cloned using RT-PCR method and bioinformatics analysis were carried out. The ORF(open reading frame) of NAD-ME was 1902bp length, encoding a hydrophilic protein of 634 amino acids. It was mainly composed of α helix (44.16%), irregular curl (39.91%) and a small amount of β-folding (15.93%), and had close phylogenetic relationships with Zizyphusjujuba. The ORF of NADP-ME was 1 926 bp length, encoding a hydrophilic protein of 642 amino acids. It mainly composed of α helix (37.07%), irregular curls (45.64%) and a small amount of β-folding (15.29%), and had close phylogenetic relationships with mulberry. These results provide a foundation to explore the molecular regulatory mechanism of malate metabolism in sea buckthorn.

Keywords　Sea buckthorn; Malic enzyme; Cloning; Bioinformatics analysis

沙棘(Hippophae rharnnoides)是胡颓子科沙棘属(Hippophae L., Elaeagnaceae)多年生落叶小乔木或灌木，耐旱抗风沙，生命力强(田魏龙等, 2011)。因其可在盐碱化土地上生存，被广泛用于水土保持(Ruan et al., 2007)。沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质，如必需氨基酸、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、不饱和脂肪酸等(Raffo et al., 2004; Pop et al., 2014; Teleszko et al., 2015)，广泛应用于食品、医药、化妆品和保健品等领域(Bal et al., 2011; Suryakumar et al., 2011; Xu et al., 2011)，具有很高的经济价值。

有机酸存在于所有植物中，在不同的物种、发育阶段和组织中其积累量不同。对果实来说，有机酸对口感与风味品质有很大影响(Schulze et al., 2002)。苹果酸是沙棘果实中主要的有机酸成分(吴紫洁等，2016)。苹果酸是三羧酸(TCA)循环的中间产物，苹果酸酶(malic enzyme, ME)催化苹果酸与丙酮酸之间的可逆反应，主要参与苹果酸的降解。ME有两种形式，分别依赖于NADP和NAD。

由对番茄(Solanum lycopersicum)果实的研究结果表明，在果实发育早期，苹果酸氧化主要发生在TCA循环中，此时NADP-ME活性较低(Goodenough et al., 1985)。然而，随着果实的成熟，TCA循环活性的下降，NADP-ME活性开始增加，NADP-ME的苹果酸脱羧水平高于通过TCA循环的苹果酸脱羧水平。而NAD-ME存在于番茄发育的各个时期，只在果实成熟时下降(Bahrami et al., 2001)。NAD-ME能够向线粒体基质提供高水平的NADH，特别是当苹果酸含量丰富时，并且也能导致足够的NADH积累，从而激活非磷酸化脱氢酶。因此，NAD-ME的活性可导致足够的NADH积累，从而激活呼吸的非磷酸化途径，特别是在苹果酸含量高的时候，能够促进苹果酸的降解(Crystal et al., 2009)。本实验通过对苹果酸代谢关键基因NAD-ME、NADP-ME的克隆与生物信息学分析，为探索沙棘苹果酸代谢分子机制提供理论研究基础。

1结果与分析

1.1沙棘ME基因的克隆及序列分析

从沙棘果实中提取总RNA，反转录获得cDNA第一链，利用特异性引物进行RT-PCR 扩增，结果如图1所示，1%琼脂糖凝胶电泳检测得到条带大小为2 000 bp左右的明亮条带，与转录组数据中预测的NAD-ME和NADP-ME基因长度基本一致。

图1 沙棘果实总RNA和ME基因的RT-PCR扩增 注: M: DL5000 DNA Marker; 1: NAD-ME, 2: NADP-ME Figure 1 Total RNA of berries and amplification of ME genes in Hippophae rhamnoides Note: M: DL5000 DNA Marker; 1: NAD-ME, 2: NADP-ME

对克隆后的目的片段进行测序，利用DNASTAR软件中的Editseq程序和NCBI ORFfinder在线软件对序列进行开放阅读框检索及分析，结果表明，NAD-ME基因的ORF序列长为1 902 bp，编码634个氨基酸，NADP-ME基因的ORF序列长为1 926 bp，编码642个氨基酸(表1)。

表1 ME基因编码蛋白的氨基酸序列 Table 1 Amino acid sequences encoded by ME genes

1.2沙棘ME基因编码蛋白的理化性质分析

蛋白质理化性质包括蛋白质的等电点、分子量、亲疏水性以及不稳定系数等性质。疏水性大于0为疏水蛋白，小于0为亲水蛋白，不稳定系数以40为界限，40以上稳定性会越来越差。NAD-ME蛋白质分子式为C₃₁₅₄H₄₉₉₅N₆₇₇O₉₂₉S₂₇，分子量70 930.29 KD，等电点为6.38，疏水性总体平均值为−0.205，属于亲水性蛋白。蛋白质的不稳定指数为38.24，较为稳定。NADP-ME蛋白质分子式为C₃₁₆₅H₅₀₂₆N₈₆₈O₉₃₄S₂₄，分子量70 951.42 KD，等电点为6.82，该蛋白的疏水性总体平均值为−0.174，属于亲水性蛋白。蛋白质的不稳定指数为 45.02，不稳定指数偏高。

1.3沙棘ME基因编码蛋白的生物信息学分析

NAD-ME在300~400bp之间有两个跨膜区，NADP-ME未出现跨膜结构域(图2)。如图3所示，NAD-ME最大疏水值为2.3，最大亲水值为2.5。NADP-ME最大疏水值为2.5，最大亲水值为2.9。NAD-ME和NADP-ME均为亲水性蛋白，亲水性较强。由图4可见，NAD-ME蛋白存在84个磷酸化位点，NADP-ME存在94个磷酸化位点，活性较高，可以与重要的功能分子结合发生作用，在第二信使传递以及酶联反应中都起到重要的作用。

图2 NAD-ME, NADP-ME蛋白质跨膜结构域预测 Figure 2 Prediction of NAD-ME and NADP-ME protein transmembrane regions

图3 NAD-ME, NADP-ME蛋白质亲疏水性预测 Figure 3 Prediction of hydrophobicity of NAD-ME and NADP-ME proteins

图4 NAD-ME, NADP-ME蛋白质磷酸化位点预测 Figure 4 Prediction of protein phosphorylation sites of NAD-ME and NADP-ME proteins

将翻译出的氨基酸序列放入PredictProtein在线软中分析，得到蛋白质的二级结构原件。如图5所示，NAD-ME蛋白α-螺旋占44.16%，无规则卷曲占39.91%，β-折叠占15.93%，无DNA结合结构域。NADP-ME蛋白α-螺旋占37.07%，无规则卷曲占45.64%，β-折叠占17.29%。该蛋白在30 bp左右出现两个DNA结合结构域，能与DNA结合发挥作用。

图5 NAD-ME、NADP-ME蛋白的二级结构预测 Figure 5 Prediction of secondary structure of NAD-ME and NADP-ME proteins 注: 1:α-螺旋; 2:β-折叠; 空白: 无规卷曲; 3: 蛋白结合结构域; 4: DNA结合结构域 Note: 1: α-helix; 2:β-sheet; Blank Space: random coil; 3: protein binding domain; 4: DNA-binding domain

在Swiss Model软件中进行蛋白质三级结构的预测及建模。如图6所示，NAD-ME三级结构复杂程度较高，其中α-螺旋数量最多，β-折叠只占少数。而NADP-ME三级结构较为对称，其中无规则卷曲所占比重最大，同样β-折叠只占少数。

图6 NAD-ME, NADP-ME蛋白质三级结构预测 Figure 6 Prediction of tertiary structure of NAD-ME and NADP-ME proteins

1.4沙棘ME同源蛋白的比对及系统进化分析

利用NCBI的BlastP工具分析沙棘与其他植物NAD-ME和NADP-ME氨基酸序列的同源性(相似性＞80%)。结果表明，沙棘NAD-ME蛋白与鼠李科枣(Ziziphus jujuba) (88.63%)、桑科大麻(Cannabis sativa) (88.52%)和大戟科橡胶树(Hevea brasiliensis) (88.01%)的NAD-ME同源性高，说明该蛋白在不同科植物间的进化相对保守。沙棘NADP-ME蛋白与桑科川桑(Morus notabilis) (82.76%)和胡桃科核桃(Juglans regia) (82.12%)的NADP-ME同源性较高。

利用MEGA7.0软件对沙棘苹果酸酶ME与其他物种ME蛋白的氨基酸构建系统进化树(图7)。不同科属植物的ME蛋白聚在一起，表明苹果酸酶具有种属间特异性。如图7所示，沙棘NAD-ME与鼠李科的酸枣(Ziziphus jujuba)聚在同一进化分支上，与前面的同源性比对结果一致；沙棘NADP-ME与胡桃科的核桃(Juglans regia)在同一分支上，二者的同源性较高。

图7 沙棘与其他物种ME蛋白的同源进化分析 注: A: NAD-ME protein; B: NADP-ME protein Figure 7 Phylogenetic analysis of ME proteins from Note: A: NAD-ME protein; B: NADP-ME protein

2讨论

苹果酸酶(ME)广泛存在植物中，是苹果酸代谢途径中的关键酶(Fernie and Martinoia, 2009)。NADP-ME可在胞质溶胶中从苹果酸和NADP⁺生成呼吸底物丙酮酸和NADPH，从而参与果实成熟过程中的苹果酸降解。在葡萄成熟过程中，NADP-ME的活性显著增加，提纯得到的NADP-ME能够促进苹果酸和OAA产生丙酮酸，参与苹果酸的降解过程(Or et al., 2000)。对番茄的研究发现，NAD-ME在发育的所有阶段都存在，仅在果实成熟后，其活性才会下降(Bahrami et al., 2001)。另外，NAD-ME能够向线粒体基质提供高水平的NADH，当苹果酸含量丰富时，造成足够的NADH积累，从而激活非磷酸化脱氢酶参与苹果酸的降解。郭元元等(2017, 山东师范大学, pp.47)还发现甜高粱的NADP-ME基因能够提高拟南芥幼苗在盐胁迫下的光合能力，从而推测NADP-ME基因与耐盐性相关。

本研究克隆到的沙棘NAD-ME基因的完整开放阅读框长1 902bp，编码一个由634个氨基酸组成的非分泌性亲水性蛋白，主要由α-螺旋(44.16%)、无规则卷曲(39.91%)和少量β-折叠(15.93%)构成。与酸枣、大麻及橡胶树同源性高达88%以上。董庆龙^[6]等对苹果的研究表明NAD-ME基因与葡萄(XP_002266697)的同源性比对为87%，本研究中沙棘NAD-ME基因与葡萄(XM_002265729.4)同源性为85.27%，结果相近。沙棘NADP-ME的完整开放阅读框长1 926 bp，编码一个由642个氨基酸组成的非分泌性亲水性蛋白，主要由α-螺旋(37.07%)、无规则卷曲(45.64%)和少量β-折叠(15.29%)构成。与川桑、核桃和酸枣的同源性平均达82.17%。郭元元等(2017, 山东师范大学, pp.47)发现甜高粱的NAD-ME和NADP-ME编码蛋白都以α-螺旋和无规则卷曲为主，均为亲水性蛋白，与本研究结果一致。李平等(2010)克隆了籽粒苋NAD-ME基因，获得的cDNA序列的开放阅读框长度为1 872 bp，编码623个氨基酸，与本研究结果相近。

目前，关于沙棘苹果酸酶的研究鲜有报道，本研究克隆到沙棘NAD-ME和NADP-ME的cDNA序列，并对编码蛋白进行生物信息学分析，为沙棘苹果酸酶的功能验证提供理论基础。

3材料与方法

3.1试验材料

试验所用的沙棘果实于2018年8月在黑龙江农业科学院浆果研究所采集，-80 ℃保存。

3.2果实总RNA的提取及反转录

使用柱式植物的总RNA抽提纯化试剂盒(生工, 上海)提取果肉(果实去除种子)总RNA，根据PrimeScript TM RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒(Takara, 大连)操作合成cDNA第一链。

3.3引物设计

根据课题组前期获得的沙棘果实转录组测序数据，参照表达载体pCAMBIA1300mCherry的酶切位点在https://www.takarabio.com/ learningcenters/cloning网站设计ME基因(包括NAD-ME和NADP-ME)扩增的引物序列(表2)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表2 NAD-ME和NADP-ME基因的扩增引物 Table 2 The primers of NAD-ME and NADP-ME

3.4沙棘ME基因的cDNA克隆

以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件如下：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，MgCl₂ 2.5 μL，cDNA 2μL，dNTP Mixture 4 μL，正、反向引物各1 μL，Ex Taq 0.3 μL，ddH₂O 15.7 μL。反应程序为：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，90 s延伸，35个循环；72 ℃，10 min。取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测；紫外灯下观察拍照，将PCR产物纯化。PCR扩增产物的纯化参考DNA Fragment Purification Kit No.9761试剂盒(大连宝生物公司)进行实验。目的基因的连接与转化参考pMDTM19-T Vector Cloning Kit No.60132试剂盒(大连宝生物公司)进行，将连接产物转化 DH5α 感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的 LB 平板。阳性单克隆提取质粒，酶切鉴定后选取片段大小正确的重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

3.5生物信息学分析

利用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ORF Finder和DNASTAR软件查找ME基因的开放阅读框并获得氨基酸序列；使用ExPASy ProtParam软件进行蛋白质的理化性质分析；跨膜结构域、疏水性和磷酸化位点分别使用TMHMM Server V.2.0、ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)和NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析；蛋白质的二级结构和三维结构建模分别使用在线软件PredictProtein和SwissModel分析；使用NCBI中的BlastP进行ME蛋白同源性比对并利用 MEGA7.0 进行 N-J 系统进化树的构建。

作者贡献

黄瑶为实验主要完成人，负责实验数据分析和文章的撰写；李贺负责实验设计及文章的修改编辑；包博闻和黄兰参与完成实验和结果分析；黄佳妮和范宇畅负责文献的收集和数据整理。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由2019年度大连民族大学大学生创新创业训练计划项目(201912026174)和辽宁省自然科学基金计划项目(2020-MZLH-09)共同资助。

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